细胞体外培养用水中水的质量要求

提起细胞体外培养实验，每个经历过的实验者都会有这样的领悟吧，

细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋。

明明小心翼翼的操作，

细胞总会莫名其妙的被污染了！

莫名其妙的挂掉啦！

到底怎么回事呢？

其实造成细胞污染的因素不单单是微生物，培养环境中所掺杂的物质也可能会影响细胞的生长。水是细胞赖以生存的主要环境，营养物质和代谢产物都必须溶解在水中，才能为细胞吸收和排泄。对于体外培养的细胞来说，水是所有细胞培养液和试剂中简单、但也是重要的组分。所以，细胞培养对水的质量要求较高，培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。

水中的杂质对水质有不同影响：

1.离子——平衡渗透压；一些重金属 (Cadmium)对细胞毒害大，即便剂量很低 (< 0.1 ppb)； 

2.微生物——污染，改变微环境如pH，影响增殖，死后释放内毒素等；

3.内毒素——改变细胞外形、活化细胞、促进或抑制细胞分裂、影响细胞附着等；

4.有机物——影响细胞的生长状态。

水质评价常用的指标：

1. 电阻率（electrical resistivity）

衡量实验室用水导电性能的指标，单位为MΩ•cm，随着水内无机离子的减少电阻数值逐渐变大。

2. 异体菌落数（Heterotrophic bacteria count，HBC）

衡量实验室用水微生物的指标，单位为cfu/mL。

3. 有机物（Total Organic Carbon ，TOC）

水中碳的浓度，反映水中可氧化的有机化合物的含量，可间接反映出水中细菌和内毒素含量的高低。单位为ug/L或ppb。

4. 内毒素（Endotoxin）

革兰氏阴性细菌的脂多糖细胞壁碎片，又称之为“热原”，单位EU/mL。

参考国际标准化组织的实验室纯水规范ISO3696，美国CLSI和ASTM D1193的试剂纯水规范，我国GBT6682和GBT 30301的试验用水指导，《实验细胞资源的描述标准与管理规范》用水指导，结合多年的实验操作经验，总结出细胞培养用水对水质的要求。

细胞培养对水质的要求：

1.一定要无菌：HBC < 0.01 cfu/mL

2.无蛋白及核酸酶和内毒素：无内毒素或无热源<0.03EU/mL

3.阻碍细胞生长的有机物含量要低：TOC <5 ppb

4.去除离子含量：电阻率≥18 MΩ•cm(@25℃)

细胞体外培养用水中纯水机的配置要求

细胞培养过程中，各种培养液和试剂的配制用水均需要经过严格的纯化处理，不含离子和其他的杂质，即使是储存试剂的玻璃器皿，在自来水冲洗过后也应用超纯水漂洗三次以上。目前，市场上供应的纯水装置种类较多，比如自来水进水同时制备二级纯水和超纯水的上海乐枫Genie一体化纯水装置，可以由自来水进水通过预处理柱P Pack、反渗透柱RO Pack及EDI（连续电流电去离子）模块等纯化后达到二级纯水，储存于水箱中以满足日常的清洗应用；水箱中的水再经过U Pack超纯化柱去离子，紫外灯照射杀菌并降低有机物含量，最后经终端滤器RephiBio过滤，以获得无菌、无热源、无核酸酶的超纯水。

Genie G 水路图

要想达到细胞培养用水的水质要求，纯水机的配置很关键，带有消毒模块的纯水水箱、终端过滤器、取水水质的实时监测等配置都关系着产水水质是否达标。

纯水的储存对保持纯水的质量是至关重要的，由于周围环境和空气中的二氧化碳更容易使水污染改变其pH，所以储存水的容器要尽量密封，避免和外界过多接触，抑制微生物生长。如Genie纯水设备可以提供的纯水水箱带有紫外消毒模块和去除二氧化碳的过滤器，能够尽可能的保证水箱内的纯水水质。

水箱空气过滤器（含CO2吸附剂）	200/350L 水箱空气过滤器
主控屏显示水箱水循环状态

终端滤器可用于去除纯水中特定类型的污染物，满足不同实验的应用需求。对于细胞体外培养可以选用RephiBio Filter 纯水终端过滤器，安装在乐枫超纯水系统的出水口，可有效去除水中的热原（内毒素）、核酸酶、细菌等杂质，制备符合细胞培养用水要求的超纯水（无热原、无DNase、无RNase、无菌）。

对于超纯水而言需要格外注意终端水质的TOC、电阻率、细菌和内毒素的含量，必须做到即取即用，因此取水的远程监控和水质实时监测就显得尤为重要。目前已有厂家可以提供与手柄通过无线连接的 机（如上面提到的Genie），将水机和取水手柄分别放在洁净间的内外，通过无线控制取水手柄达到超纯水的取用和实时检测水的电阻率和TOC数值，适合无菌环境下的操作，尽可能减少污染。

无线 · 自由
局域网无线通信技术  各单元摆脱信号线羁绊 主机，主控屏，手柄摆放可自由组合

	手柄触屏信息  系统运行状态：待机，泄压，循环，产水  水箱液位：0%或者L  纯水（超纯水）水质参数：电阻率、TOC、温度
	终 端 水 质                  实 时 监 测

结合上述用水要求，为大家介绍两款制备超纯水的水机，Genie G一体化纯水仪和Genie PURIST 超纯水仪。

 

Genie G一体化纯水仪 以自来水为进水制备超纯水和 EDI 二级纯水	性能指标
Genie PURIST 超纯水仪 以纯水（EDI 纯水，RO 水或蒸馏水等）为进水，制备实验室超纯水。	性能指标

【注意事项】

1.超纯水应当注意使用时间，应该“即取即用”。防止超纯水吸收外界的杂质导致水质下降。

2.在合适的环境使用超纯水。环境中的VOC（挥发性有机物），细菌等都会影响细胞培养。

3.培养细胞的容器应当洁净无污染。 

4.配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用钙、镁离子含量低的缓冲液，缓冲液用水可以选用装配乐枫低镁型纯化柱的纯水机，避免钙、镁离子促使细胞凝聚作用的产生。

不同细胞体外培养用水选择指南

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养的整个流程中实验用水贯穿每一个环节：

1.取材：组织的清洗和灌注试剂用水，如PBS缓冲液、Hanks液的配制；

2.原代培养：1640、DMEM等培养基用水，明胶等支持物的配制，添加药物、检测试剂的配制；

3.传代培养：胰酶等消化液的配制；

4.冻存：细胞冻存液DMSO的配制。

细胞体外培养的细胞类型一般分为动物细胞培养、植物细胞培养和微生物培养，其中最难的是动物细胞的培养。动物细胞的培养除了需要无菌、温度、气体、渗透压、pH等基本条件，它还需要血清、支持物等特殊物质，其中原代细胞的培养是最难的。植物细胞的培养需要光照和激素，而且培养条件和培养技术比较成熟。微生物培养多为单细胞生物，微生物人工培养的条件比动植物细胞简单得多，蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等天然培养基即可满足微生物的营养要求，其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，需要维持CO2等非氧惰性气体的浓度。

由于细胞的种类和培养条件不同，对培养环境中杂质的含量要求也不同，那么配制培养基或试剂用水的选择大有讲究，不同细胞体外培养用水的指标如下：

细胞体外培养用水选择

细胞类型	纯水等级	电阻(MΩ•cm)	TOC(ppb)	微生物(cfu/mL)	内毒素(Eu/mL）	核酸酶(pg/mL)
动物细胞	超纯水	>18	<10	<1	<0.002	ND
植物细胞	超纯水	>18	<10	<1	<0.002	ND
微生物	实验室Ⅱ级纯水	>10	<50	<1	NA	NA

从上表可以看出，动物细胞和植物细胞的培养对去除内毒素和核酸酶的要求很高，用于这两类细胞培养可以选择商品化的细胞培养用水，另外去除纯水中的内毒素和核酸酶可以通过在纯水机的取水口安装终端滤器达到。

各种细胞培养用水的比较

细胞培养用水	制备方法	优点	缺点
商品化细胞培养用水	纯水或超纯水进行多效蒸馏制成，严格控制热源、无菌、内毒素、pH、渗透压等指标	水质标准程度化高，可保证实验结果的重复性	价格昂贵
DEPC水	DEPC处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，无RNase、DNAase和proteinase。	完全去除核酸酶	价格昂贵，未去除内毒素
终端滤器过滤纯水	采用0.22µm的过滤膜，可有效去除水中的热原（内毒素）、核酸酶、细菌等杂质。	性价比高，供水量大	对取水环境要求高

乐枫 RephiBio 终端过滤器采用0.22µm带正电荷的双层尼龙66过滤膜，可制备符合生物领域应用要求的超纯水（无热原、无DNase、无RNase、无菌），纯水中内毒素含量低于0.001 Eu/mL，核酸酶的含量低于可检测范围，微生物的含量低于0.1 cfu/mL，可以满足动物细胞和植物细胞的需求。

Tips: 通常情况下乐枫RephiBio 终端过滤器的更换周期为3 个月，以达到好的使用效果。